نقش مجله 6 - دانشكده آمينونيكوتين پزشكي آميد در دانشگاه علوم مقاومتپزشكي تهران ماكروفاژهايدوره صفاقي 64 موش شماره 9 ا ذر BALB/c آلوده 1385 به انگل 10-18 ليشمانيا ماژو نقش 6 -آمينونيكوتين آميد در مقاومت ماكروفاژهاي صفاقي موش BALB/c آلوده 1 شهرزاد زماني تقي زاده رابع * 1 احمد زواران حسيني 2 سيد عليرضا مصباح نمين 1. گروه ايمني شناسي 2. گروه بيوشيمي دانشكده علوم پزشكي دانشگاه تربيت مدرس چكيده به انگل ليشمانيا ماژور زمينه و هدف: ارتباط مهار آنزيم گلوكز- 6 - فسفات دهيدروژناز در ماكروفاژهاي تيمار شده با مهار كننده 6 -آمينونيكوتين آميد با ميزان توليد نيتريك اكسايد و نيز مقاومت ماكروفاژهاي آلوده به انگل ليشمانيا ماژور بررسي شد. روش بررسي: ماكروفاژهاي صفاقي موش BALB/c و با غلظت هاي 10 و 5 و 2/5 و 1/25 ميلي مولار از مهار كننده 6 -آمينونيكوتين آميد تيمار شدند. بعد از 24 ساعت انكوباسيون درصد سايتوتوكسيسيتي ماكروفاژها با استفاده از تستMTT بررسي و ميزان كاهش فعاليت آنزيم گلوكز - 6- فسفات دهيدروژناز( G6PD ) تعيين شد. ماكروفاژها را با انگل ليشمانيا ماژور آلوده نموديم و توليد نيتريك اكسايد (NO) بعد از 18 ساعت با استفاده از روش رنگ سنجي گريس (Gries) سنجيده و از غلظت پنج ميلي مولار براي بررسي تاثير بر ميزان تكثير انگل در ماكروفاژها از روز يك تا روز هفت استفاده شد. يافتهها: با افزايش غلظت 6 آمينونيكوتين آميد درصد سايتوتوكسيسيتي ماكروفاژها افزايش و فعاليت آنزيم G6PD ميزان توليد كاهش يافت. NO توسط ماكروفاژها با افزايش غلظت 6 -آمينونيكوتين آميد نسبت معكوس داشت. بررسي انگل در ماكروفاژها نشان داد كه ميزان تكثير انگل از روز يك تا روز هفت بررسي نسبت به گروه كنترل افزايش چشمگيري دارد (0/05>P). نتيجهگيري: فعاليت آنزيم G6PD با استفاده از مهار كننده 6 آمينونيكوتين آميد كاهش مي يابد. فعاليت آنزيم G6PD با كاهش توليد NO و افزايش درصد سايتوتوكسيسيتي ماكروفاژها همراه است. از آنجايي كه NO نقش اصلي را در فعاليت ليشمانيا كشي ماكروفاژها به عهده دارد با مهار آنزيم G6PD فعاليت ليشمانيا كشي ماكروفاژها كاهش مييابد. *نشاني: تهران دانشگاه تربيت مدرس دانشكده علوم پزشكي گروه ايمني شناسي تلفن تماس: 88011001 پست الكترونيك: zavarana@modares.ac.ir كلمات كليدي: ليشمانيا ماژور گلوكز- 6 - فسفات دهيدروژناز نيتريك اكسايد تست MTT 6 -آمينونيكوتين آميد.
و 9 11 شهرزاد زماني و همكاران ماكروفاژها سلولهاي ايمني هستند كه در دفاع عليه عوامل عفوني نقش مهمي ايفا ميكنند. مكانيسمهاي ميكروبكشي ماكروفاژها عمدتا شامل توليد راديكالهاي فعال اكسيژن و 1 توليد نيتريك اكسايد (NO) ميباشد. مسير متابوليكي پنتوز فسفات كه در اكثر سلولها وجود دارد مهمترين منبع توليد كننده NADPH در داخل سلولها ميباشد. NADPH توليد شده كوآنزيم فعاليت بسياري از آنزيمهاي مهم از جمله كمپلكس آنزيمي نيتريك اكسايد سنتاز 2 ماكروفاژها است. آنزيم گلوكز- 6 - (NOS) (G6PD) در داخل فسفات دهيدروژناز آنزيم محدود كننده سرعت و مهمترين آنزيم اين مسير متابوليكي است و مهار آن منجر به كاهش شديد ميزان NADPH 3-5 داخل سلولي ميشود. مهاركننده رقابتي آنزيم G6PD 6 -آمينونيكوتين آميد است و بررسيهاي مختلف نشان دادهاند كه تيمار سلولهاي مختلف توسط اين ماده منجر به كاهش چشمگير ميزان همچنين G6PD توكسوپلاسما مشخص شده 6-8 NADPH داخل سلولي ميشود. در افرادي كه دچار نقص در آنزيم ميباشند ميزان ابتلا به عفونتهاي مختلف از جمله ريكتزيا و هليكوباكتر پيلوري و بيماري حاصله افزايش مييابد. 9-11 نيز شدت در اين مطالعه اثر مهار G6PD در فعاليت ميكروبكشي ماكروفاژها از انگل ليشمانيا ماژور به عنوان يك مدل استفاده شد. زيرا انگل ليشمانيا ماژور عامل ايجاد ليشمانيوزيس است كه هنوز در شهرهاي مختلف ايران وجود داشته و تلاش براي ريشهكن كردن آن همچنان ادامه دارد. 8 همچنين ماكروفاژها مهمترين سلولهايي هستند كه توسط اين انگلها آلوده ميشوند يعني در واقع مخزن ليشمانيا هستند و مهمترين مكانيسم ليشمانياكشي آنها توليد نيتريكاكسايد (NO) ميباشد و همانطور كه ذكرشد توليد NO به در دسترس بودن كوآنزيم NADPH به مقدار كافي در 12-17 و 2 سلولها بستگي دارد. موشهاي براي جداسازي هفتهاي) (8-9 ماده BALB/c ماكروفاژها مورد استفاده قرار گرفتند. در ابتدا به صفاق موش RPMI تزريق شد و سپس مايع صفاقي موش تحت شرايط استريل آسپيره شد. سوسپانسيون سلولي آسپيره شده را دوبار با PBS شستشو داده و بعد از سانتريفوژ سلولها با دور 300g به مدت ده دقيقه مايع رويي را دور ريخته و توده سلولي ته لوله در يك ميليليتر RPMI حاوي %10 FCS به حالت سوسپانسيون درآورده شد سپس ماكروفاژها را شمارش كرده و به تعداد 10 6 رسانده و درصد زنده بودن آنها تعيين شد. از موشهاي BALB/c مخزن استفاده شد. آلوده به انگل ليشمانيا ماژور به عنوان ابتدا موش را كشته و طحال آن را در شرايط استريل جدا كرده و در داخل محيط كشت NNN قرار داديم. محيط مذكور را در دماي 25 درجه سانتيگراد قرار داده و پس از 48-72 ساعت رشد انگل بررسي كرديم. براي رشد بيشتر ابتدا انگل را به محيط كشت RPMI 1640 بدون سرم جنين گاو (FCS) بعد از رشد اوليه انگل آن را به محيط كشت حاوي %10-20 RPMI 1640 سرم جنين گاو غير فعال ١٨ شده انتقال داديم. در اوايل دهه 1980 موسمان به توضيح 19 اين روش پرداخت. در هر چاهك ميكروپليت 96 خانهاي 100 ميكروليتر از سوسپانسيون سلولي بهدست آمده از صفاق موش اضافه كرده و سلولها در گروههاي مجزا با غلظتهاي مختلف از مهاركننده 6 -آمينونيكوتين آميد (10 و 5 و 2/5 و 1/25 ميليمولار ( تيمار شدند. سپس ميكروپليت به مدت 24 ساعت در 37 درجه سانتي گراد و %5 CO2 قرار گرفت. بعد از اين مدت درصد سايتوتوكسيسيتي سلولها توسط تست {Methyl-2,5diphenil Tetrazolium bromide3- MTT (4,5-Tetrazolium)} تعيين شد. محلول حاوي MTT مقدمه روش بررسي با غلظت پنج ميليگرم در ميليليتر تهيه شد و 25 ميكروليتر از آن به هر چاهك اضافه شد. بعد از چهار ساعت انكوباسيون
نقش 6- آمينونيكوتين آميد در مقاومت ماكروفاژهاي صفاقي موش BALB/c آلوده به انگل ليشمانيا ماژو 12 در 37 درجه سانتيگراد 100 ميكروليتر دي متيل سولفوكسايد (DMSO) به تمام چاهكها اضافه شد و كاملا مخلوط شد تا تمام بلورهاي آبي تشكيل شده حل شوند. سپس پليت توسط دستگاه Multiscan MS ELISA Reader در طول موج 570 نانومتر قراي ت گرديد. براي سنجش غلظت نيتريك اكسايد (NO) از دو گروه ماكروفاژ يكي ماكروفاژ تيمار شده با مهاركننده و يكي ماكروفاژهاي آلوده شده با انگل ليشمانيا كه با مهار كننده تيمار شده بودند استفاده شد. از ماكروفاژهاي تيمار شده با SNAP كه تقويتكننده مسير توليد نيتريك اكسايد است همراه با انگل ليشمانيا ماژور IFN-γ + SNAP و IFN-γ + LPS به عنوان كنترل مثبت استفاده شد زيرا نشان داده شده است كه اين مواد توليد NO توسط ماكروفاژها را تحريك ميكنند. از NMMA نيز در ماكروفاژهاي آلوده به ليشمانيا به عنوان كنترل منفي استفاده شد زيرا اين ماده مهار كننده توليد NO ميباشد. ميزان تجمع NO2 به عنوان شاخص ميزان توليد NO در مايع رويي سلولهاي كشت داده شده توسط روش رنگ سنجي گريس و استفاده از منحني استاندارد نيتريت سديم تعيين شد. 50 ميكروليتر از مايع رويي ماكروفاژ هاي كشت داده شده با 50 ميكروليتر از محلول حاوي نفتيل اتيلن آميد دي هيدروكلرايد mg/ml) 0/1) سولفانيل آميد mg/ml) 1) %5 اسيد فسفوريك و آب مقطر به مدت ده دقيقه در دماي اتاق انكوبه شد سپس جذب نمونهها در 540 نانومتر قراي ت گرديد. فعاليت آنزيم G6PD (فعاليت ويژه بر حسب (u/mg در عصاره سلولي ماكروفاژهاي ليز شده تعيين شد. براي انجام اين تست نيز همانند تست سنجش ميزان توليد NO از دو گروه ماكروفاژ استفاده شد: ماكروفاژ همراه با مهاركننده و ماكروفاژ آلوده به ليشمانيا همراه با مهاركننده ماكروفاژهاي صفاقي جدا شده سانتريفوژ شده (200g به مدت ده دقيقه در چهار درجه سانتيگراد) سپس در PBS به حالت سوسپانسيون Cells/ml) 10 5) 5 درآورده و براي ليز تحت سونيكاسيون intervals) (6 times,10-s burst with 1-min قرار داده شدند. عصاره سلولي قبل از سنجش به مدت 20 دقيقه با دور 12000g با دماي چهار درجه سانتيگراد سانتريفوژ شده و قبل از سنجش روي يخ نگهداري شد. 200 ميكروليتر از عصاره سلولي با 0/75 ميليليتر از بافرتريس-اسيدكلريدريك پنجمولار حاوي MgCl 2 مولار و سه ميليمولار 7.8) (ph 25 ميكروليتر از گلوكز- 6 -فسفات 4/7 7/8 NADPH مولار مخلوط شده و افزايش جذب NADPH بعد از پنج دقيقه انكوباسيون در 37 درجه در طول موج 339 نانومتر قراي ت شد. ماكروفاژهاي صفافي موش BALB/c همراه با محيط كشت RPMI 1640 حاوي FBS %10 غير فعال شده با حرارت به داخل پليت هاي 16 خانهاي ريخته شدند. بعد از 24 ساعت آماستيگوتهاي ليشمانيا ماژور به نسبت 1:20 (آماستيگوت به ماكروفاژ) اضافه شدند. چهار ساعت بعد به محيط رويي محيط حاوي آماستيگوت هاي آزاد اضافه شد. روز بعد محيط كشت رويي با محيط كشت تازه حاوي غلظتهاي مختلف مهاركننده تعويض شد. ميكروپليت در 37 درجه سانتيگراد و حضور %5 CO 2 انكوبه شد. از روز يك تا روز هفت ماكروفاژهاي هر چاهك از ته پليت جدا شده روي اسلايد قرار داده و بعد از فيكس كردن با متانول با استفاده از رنگ گيمسا رنگآميزي شد و تعداد ماكروفاژهاي آلوده به غير آلوده و نيز تعداد آماستيگوت هاي موجود در هر ماكروفاژ به صورت درصد با استفاده از بررسي در زير ميكروسكوپ تعيين شد. نتايج حاصل از تستها با استفاده از نرم افزار SPSS و روشهاي آناليز آماري غير پارامتريك Mann-Witney و ANOVA مورد تجزيه و تحليل قرار گرفت. يافتهها همانطور كه در جدول شماره 1 مشخص شده است نتايج حاصل از انجام تست MTT بر روي ماكروفاژهايي كه با غلظتهاي مختلف مهاركننده 6 -آمينونيكوتين آميد (10 و 5 و 2/5 و 1/25 ميليمولار) به مدت 18 ساعت تيمار شده بودند
13 شهرزاد زماني و همكاران از ليز ماكروفاژهاي تيمار شده با غلظتهاي مختلف مهاركننده 6 -آمينونيكوتين آميد( 10 و 5 و 2/5 و 1/25 ميليمولار) مشخص شد كه استفاده از اين مهاركننده منجر به كاهش معني داري در فعاليت آنزيم G6PD در ماكروفاژها ميشود و هر چه غلظت مهار كننده بيشتر باشد درصد مهار آنزيم نيز افزايش مييابد. همانطور كه در نمودار شماره 1 مشخص شدهاست غلظتهاي مختلف مهاركننده از نظر ميزان مهار آنزيم G6PD با گروه كنترل و نيز با يكديگر تفاوت معنيداري (0/001 >p) داشتند. همچنين تجزيه و تحليل با آزمون آماري ANOVA نشان داد كه انگل ليشمانيا نميتواند منجر به افزايش معني داري در فعاليت آنزيم G6PD در ماكروفاژهاي آلوده شود (p >0/05 ) بعد از بررسي ماكروفاژهاي رنگ آميزي شده توسط گيمسا نسبت ماكروفاژهاي آلوده به غيرآلوده و نيز ميانگين تعداد آماستيگوتها در ماكروفاژهاي آلوده بعد از بررسي توسط ميكروسكوپ تعيين شد و همانطور كه در جدول شماره 3 مشخص شده است ميانگين تعداد آماستيگوتها در ماكروفاژهاي آلوده كه با غلظت پنج ميلي مولار از مهار كننده 6 -آمينونيكوتين آميد تيمار شده بودند با افزايش زمان از روز يك تا روز هفت نسبت به گروه كنترل در تجزيه و تحليل با آزمون آماري ANOVA افزايش معنيداري نشان ميدهد اكثر ماكروفاژهاي آلوده توسط انگل ليشمانيا تخريب شده بودند. نشانداد كهبا افزايش غلظت مهاركننده درصد سايتوتوكسيسيتي ماكروفاژها كاهش معنيداري مييابد( p<0/001 ) همچنين آزمون آماري ANOVA نشان داد كه بين ميزان سايتوتوكسيسيتي ايجاد شده توسط غلظت هاي مختلف از مهار كننده با هم نيز تفاوت قابل توجهي (0/001>p) وجود داشت. نتايج حاصل از سنجش ميزان نيتريك اكسايد توليد شده بعد از 18 ساعت توسط ماكروفاژهاي تيمار شده با غلظتهاي مختلف مهار كننده 6 -آمينونيكوتين آميد (10 و 5 و 2/5 و 1/25 ميلي مولار) كه در جدول شماره 2 آمده نشان داد كه تيمار ماكروفاژها با اين مهاركننده ميزان توليد نيتريك اكسايد توسط ماكروفاژها را كاهش قابل توجهي مي دهد و اين كاهش با افزايش غلظت مهار كننده رابطه مستقيم دارد. ميزان NO توليد شده توسط ماكروفاژهاي تيمار شده با غلظت هاي مختلف از مهاركننده كاهش قابلتوجهي نسبتبه ماكروفاژهاي گروه كنترل (0/001>p) داشت. همچنين بين ميزان NO توليد شده توسط گروههاي مختلف با يكديگر نيز تفاوت قابل معني داري وجود داشت (0/001>p). آزمون آماري Mann-Witney نشان داد كه در گروه ماكروفاژهاي آلوده به انگل ليشمانيا كه با غلظتهاي مختلف از مهاركننده تيمار شده بودند ميزان توليد NO نسبت به گروه فاقد انگل ليشمانيا و نيز نسبت به ساير غلظتهاي همان گروه كاهش معنيداري نشان نداد (0/001<p). با سنجش فعاليت آنزيم G6PD در عصاره حاصل ١ جدول 1 - نتايج حاصل از انجام تستMTT بعد از 18 ساعت توسط مهاركننده آنزيم G6PD ( 6 -آمينونيكوتين آميد) بر ماكروفاژها مواد و سلول اضافه شده گروه ها ماكروفاژ + 6-AN با غلظت 10 ميلي مولار درصد سايتوتوكسيسيتي در ماكروفاژهاي صفاقي موش ) S.D ( mean ± 2/12 ± 0/06 ٢ ماكروفاژ 6-AN + با غلظت 5 ميلي مولار 1/99 ± 0/1 ٢ ماكروفاژ + 6-AN با غلظت 5/2 ميلي مولار 1/86 ± 0/07 1/73 ± 0/09 ۴ ماكروفاژ + 6-AN با غلظت 1/25 ميلي مولار
نقش 6- آمينونيكوتين آميد در مقاومت ماكروفاژهاي صفاقي موش BALB/c آلوده به انگل ليشمانيا ماژو 14 جدول 2 - غلظت نيتريت توليد شده (بر حسب ميكرومولار) توسط ماكروفاژهاي صفاقي موش BALB/c مختلف مهاركننده آنزيم G6PD ( 6 -آمينونيكوتين آميد). پس از 18 ساعت انكوباسيون با غلظتهاي ماكروفاژ مواد و سلول اضافه شده گروه ها غلظت نيتريت (ميكرومولار) 33 / 34 ± 0 / 89 33 / 96 ± 0 / 90 262 / 55 ± 3 / 62 27 / 30 ± 0 / 37 269 / 87 ± 1 / 43 40 / 34 ± 0 / 87 14 / 14 ±0 / 33 15 / 09 ±0 / 29 15 / 57 ±0 / 23 16 / 66 ±0 / 13 14 / 16 ±0 / 22 15 / 10 ±0 / 29 15 / 58 ±0 / 22 16 / 68 ±0 / 13 SNAP ماكروفاژ + انگل ليشمانيا ماژور ماكروفاژ + انگل ليشمانيا ماژور+ ماكروفاژ + انگل ليشمانيا ماژور+ NMMA IFN-γ + SNAP+ IFN-γ + LPS ماكروفاژ ماكروفاژ + ماكروفاژ + 6-AN با غلظت 10 ميلي مولار ماكروفاژ + 6-AN با غلظت 5 ميلي مولار ماكروفاژ + 6-AN با غلظت 2 ميلي 5/ مولار ماكروفاژ + 6-AN با غلظت 1 ميلي 25/ مولار ماكروفاژ + انگل ليشمانيا + 6-AN با غلظت 10 ميلي مولار ماكروفاژ + انگل ليشمانيا + 6-AN با غلظت 5 ميلي مولار ماكروفاژ + انگل ليشمانيا + 6-AN با غلظت 2 ميلي 5/ مولار ماكروفاژ + انگل ليشمانيا + 6-AN با غلظت 1 ميلي 25/ مولار SNAP: S-Nitroso-Acethyl-Penicillamide NMMA: N-Methyl-L-Arginine 6-AN: 6-Aminonicotinamide 1400 1200 1000 Control Infected macrophages ١ ٢ ٣ ۴ ۵ ۶ ٧ ٨ ٩ ١٠ ١١ ١٢ ١٣ ١۴ فعاليت ا نزيمG6PD 800 600 400 200 0 1 2 3 4 5 گروه ها نمودار 1. ميزان فعاليت آنزيم G6PD در ماكروفاژهاي دو گروه بعد از انكوباسيون با غلظتهاي مختلف مهاركننده آنزيم G6PD ( 6 -آمينونيكوتين آميد). گروه 1 ماكروفاژ گروه 2 ماكروفاژ+ 6-AN با غلظت 10 ميلي مولار گروه 3 ماكروفاژ + 6-AN با غلظت 5 ميلي مولار گروه 4 ماكروفاژ + 6-AN با غلظت 5/2 ميلي مولار گروه 5 ماكروفاژ + 6-AN با غلظت 1/25 ميلي مولار.
15 شهرزاد زماني و همكاران 15 جدول 3 - اثر مهار آنزيم G6PD (توسط 6 -آمينونيكوتين آميد) بر تكثير داخل سلولي ليشمانيا ماژور ماكروفاژهاي صفاقي آلوده بهآن ماكروفاژ + انگل ليشمانيا نوع ماده اضافه شده ماكروفاژ + انگل ليشمانيا + 6-AN با غلظت 5 mm a بيش از 50 % از ماكروفاژها ليز شده اند بحث 2 1 0 خطاي معيار ± ميانگين تعداد انگل در 200 ماكروفاژ از روز صفز تا روز شش 6 a 5 14 /09 ±4/0 6-AN: 6-Aminonicotinamide 4 11 /59 ±0/ 1 a 3 9/63 ±4/0 12 /65 ±0/ 1 7/ 92 ±0/3 9/ 59 ±5/0 6/ 41 ±5/0 7/ 19 ±4/0 5/ 11 ±0/ 1 5/ 29 ±0/3 امروزه بيماري ليشمانيوز در كشور ما به عنوان يك پديده مهم مورد توجه مراكز بهداشتي و درماني كشور است. از آنجاييكه ماكروفاژها سلولهاي اصلي مخزن انگل ليشمانيا 18-20 ميباشند. بنابراين شناخت عوامل موثر بر افزايش و يا كاهش مقاومت اين سلولها به اين انگل ميتواند ما را در يافتن راهكاري جديد براي جلوگيري از پيشرفت و گسترش و يا حتي درمان اين بيماري ياري كند. از اين رو در اين تحقيق تلاش بر اين بوده است كه اثر كاهش فعاليت مسير پنتوز فسفات (ميزان توليد (NADPH به ويژه آنزيم گلوكز 6 - فسفات دهيدروژناز را كه آنزيم كنترل كننده اين مسير متابوليكي ميباشد در ماكروفاژهاي آلوده به انگل ليشمانيا ماژور بررسي نمايد. با توجه به شيوع ليشمانيوز و اهميت تشخيص و درمان مناسب آن در مناطق آلوده ما از انگل ليشمانيا ماژور به عنوان يك مدل براي بررسي اثرات مهار شدن آنزيم گلوكز- 6- فسفات دهيدروژناز در فعاليت ميكروبكشي ماكروفاژها استفاده كرديم. مسير پنتوز فسفات مسير متابوليكي اصلي توليد NADPH خارج ميتوكندريايي در سلولها محسوب ميشود و آنزيم اصلي در اين مسير كه منجر به توليد NADPH مي شود گلوكز 6 - فسفات دهيدروژناز (G6PD) مي باشد بنابراين مهار G6PD منجر به 21 كاهش شديد توليد NADPH در سلول ها مي شود. در بررسيهاي قبلي تاثير نقص G6PD در افزايش استعداد ابتلا و نيز افزايش شدت بيماريهاي عفوني مختلف ازجمله 22 10 ريكتزياها پنوموني ناشي از آسينتوباكتر عفونت توكسوپلاسما 9 و عفونت هليكوباكتر پيلوري 11 در بيماران به اثبات رسيده است. همچنين ثابت شده است كه لكوسيت هاي اين افراد داراي اختلال در فرايند كشتن عوامل عفوني بوده و ميزان توليد راديكال هاي فعال اكسيژن و نيتروژن در آنها كمتر 23-28 از سطح طبيعي ميباشد. مطالعات مختلفي درباره مكانيسمهاي كشتن انگل ليشمانيا توسط ماكروفاژها صورت گرفته است اسروي و همكاران 29 در سال 1994 نشان دادند كه كشتن انگل ليشمانيا ماژور توسط ماكروفاژهاي فعال شده عمدتا به توليد NO و تا حد كمتري به توليد راديكالهاي فعال اكسيژن از جمله سوپراكسيد وابسته است. در اين تحقيق از مهار كننده 6 -آمينو نيكوتين آميد( 6-AN ) استفاده كرديم كه از جمله موثرترين مهاركننده مسير پنتوز فسفات ميباشد و آنزيم G6PD را مهار ميكند. بعد از تيمار سلول ها با اين ماده سلولها را از نظر تست MTT ميزان توليد نيتريك اكسايد و ميزان فعاليت آنزيم G6PD مورد بررسي قرار داديم. بعد از تعيين دوز اپتيمم اين مهار كننده با توجه به تست MTT و نيز تعيين ميزان فعاليت آنزيم G6PD از اين دوز جهت بررسي مقاومت ماكروفاژهاي آلوده به انگل
نقش 6- آمينونيكوتين آميد در مقاومت ماكروفاژهاي صفاقي موش BALB/c آلوده به انگل ليشمانيا ماژو 16 ليشمانيا استفاده كرديم. با استفاده از اين مهار كننده مشاهده شد كه ميزان NADPH توليد شده فعاليت آنزيم G6PD ميزان نيتريك اكسايد توليد شده در ماكروفاژها كاهش مييابد. بنابراين آزمايشات ما با تحقيقاتي كه توسط محققين مختلف 9-11 انجام دادهاند تطبيق ميكند. NADPH توليد شده كوآنزيم مهم آنزيمهاي توليد كننده راديكال هاي فعال اكسيژن و نيتروژن از جمله سوپراكسيد و نيتريك اكسايد در ماكروفاژها ميباشد كه در دفاع ماكروفاژهاي آلوده به انگل ليشمانيا نقش اصلي را ايفا ميكنند. بنابراين انتظار مي رود كه با كاهش فعاليت آنزيم G6PD و در نتيجه كاهش ميزان NADPH در سلولها مقاومت ماكروفاژها به انگل ليشمانيا كاهش يابد. نتايج حاصل از تست MTT با استفاده از مهاركننده 6-AN بر روي ماكروفاژهاي صفاقي موش BALB/c نشان دادند كه با افزايش غلظت مهاركننده درصد سايتوتوكسيسيتي ماكروفاژها افزايش مييابد. مشاهده شد كه غلظت 10 mm تفاوت معنيداري با گروه كنترل و نيز غلظت هاي 2/5 5 و 1/25 ميلي مولار دارد (0/05 P) و اين غلظت بيشترين ميزان مهاركنندگي را داراست (0/05 P) بهطور كلي غلظتهاي 10 mm و 5 1/25 2/5 نسبت به گروه كنترل و نيز با يكديگر تفاوت معني داري از نظر ميزان مهاركنندگي دارند (0/05 P) و اين ميزان با افزايش غلظت از 1/25 mm تا 10 mm افزايش مييابد. ما براي بررسي غلظت نيتريت توليد شده در مايع رويي كشت ماكروفاژها از روش رنگ سنجي گريس استفاده كرديم. نتايج حاصل از سنجش نيتريك اكسايد نشان دادند كه بالاترين مقدار نيتريت توليدي كه شاخص توليد NO است در مجاورت SNAP در گروههاي سوم (ماكروفاژ + انگل ليشمانيا + (SNAP و پنجم (ماكروفاژ + IFN-γ (SNAP + در مقايسه با گروه كنترل (0/05 P) و نيز ساير گروهها توليد شد. علت آن ميتواند موثر بودن دهنده NO در توليد آن در مقايسه با ساير عوامل محرك سلول باشد. نتايج حاصل از تيمار ماكروفاژها با مهاركننده 6-AN نشان دادند كه استفاده از اين مهاركننده تا حد معنيداري غلظت NADPH توليد شده و فعاليت آنزيم G6PD را كاهش ميدهد و ميزان مهار با افزايش غلظت مهاركنندهها بيشتر ميشود (0/05 P). نتايج حاصل از بررسي تعداد ماكروفاژهاي آلوده با انگل ليشمانيا در طي هفت روز نشان دادند كه با افزايش غلظت مهاركننده تعداد ماكروفاژهاي آلوده به انگل ليشمانيا و تعداد انگلهاي موجود در هر ماكروفاژ افزايش مييابد (0/05 P) و اين افزايش با افزايش غلظت مهاركننده نسبت مستقيم دارد (0/05 P). در اين تحقيق به اين نتيجه رسيديم كه استفاده از مهاركننده هاي بهكار رفته براي مهار فعاليت آنزيم G6PD سبب ميشود كه ميزان توليد NADPH غلظت نيتريك اكسايد توليد شده ميزان زنده بودن ماكروفاژها و مقاومت ماكروفاژهاي آلوده به انگل ليشمانيا كاهش معنيداري مييابد. بنابراين كاهش فعاليت G6PD و غلظت NADPH در نتيجه نقص ژنتيكي يا بيماري و يا از طريق استفاده از مهاركننده منجر به كاهش توليد نيتريك اكسايد و ميزان زنده بودن ماكروفاژها ميشود كه از عوامل موثر در كشتن انگل در ماكروفاژهاي آلوده ميباشند پس سبب افزايش رشد انگل ميشوند. بنابراين توانايي ميكروبكشي ماكروفاژهاي آلوده به انگل ليشمانيا كه با مهار كننده تيمار شدهاند كاهش مييابد.
17 Tehran University Medical Journal; Vol. 64, No. 9, Dec 2006: 66-71 Zamani همكاران Sh. et و al. 102 References 1. Nathan CF, Gabay J. Antimicrobicidal mechanisms of macrophages. Mononuclear Phagocytes 1992; 12: 256-67. 2. Schwartz AG, Pashko LL. Dehydroepi-androsterone, glucose-6-phosphate dehydrogenase and longevity. Ageing Res Rev 2004; 3: 171-87. 3. كاكس م و نلسون د. اصول بيوشيمي لنينجر. دكتر رضا محمدي دوم. تهران: انتشارات آييژ 1382. صفحات 669 تا 672. 4. Zamora R, Bult H, Herman AG. The role of prostaglandin E 2 and nitric oxide in cell death in J774 murine macrophages. Euro J Pharmacol 1998; 349: 307-15. 5. Matsubara S, Takayama T, Iwasaki R, Komatsu N, Matsubara D. Enzyme-cytochemically detectable glucose-6-phosphate dehydrogenase in human villous macrophages (Hofbauer cells). Placenta 2001; 22: 882-85. 6. Kohler E, Barrach H, Neubert D. Inhibition of NADP dependent oxidoreductases by the 6-aminonicotinamide analogue of NADP. FEBS Letters 1970; 6: 225-28. 7. Yang YC, Kim JY, Park IK. Neurotoxin 6-amino nicotinamide affects level of soluble protein and enzyme activities in various tissues of golden hamsters. Int J Biochem Cell Biol 2000; 32: 549-56. 8. Gupte SA, Li KX, Sato K, Oka M. Inhibitors of pentose phosphate pathway causes vasodilation: Involvement of voltage-gated potassium channels. J Pharmacol Exp Ther 2002; 301: 299-305. 9. Tabbara KF, Sharara NA, Al-Momen AK. Toxoplasmasis in a group of glucose-6-phosphate dehydrogenase deficient patients. Saudi Med J 2001; 22: 330-32. 10. Walker DH, Hawkins HK, Hudson P. Fulminant Rocky Mountain spotted fever. Its pathologic characteristics associated with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. Arch Pathol Lab Med 1983; 107: 121-25. 11. Keenan JI, Peterson RA, Hampton MB. NADPH oxidase involvement in the pathology of Helicobacter pylori infection. J Free Rad Bio Med 2004; 25: 5-9. 12. Handman E, Bullen DV. Interaction of Leishmania with the host macrophage. Trends Parasitol 2002; 18: 332-34. 13. Assreuy J, Cunha FQ, Epperlein M, Noronha-Dutra A, Odonnell C. Production of nitric oxide and superoxide by activated macrophages and killing of Leishmania major. Eur J Immunol 1994; 24: 627-76. 14. WHO special programme for research & training in tropical diseases. Work plan of the steering committee on vaccines for Leishmaniasis, December 1996. 15. Oliveria SH, Fonseca SG, Romao PR. Nitric oxide mediates the microbicidal activity of Eosinophils. Cell Immunol 1997; 18: 68-75. 16. Au SW, Gover S, Lam VM, Adams MJ. Human glucose-6-phosphate dehydrogenase: the crystal structure reveals a structural NADP(+) molecule and provides insights into enzyme deficiency. Structure 2000; 8: 293-303. 17. Liang J, Yao G, Yang L, Hou Y. Dehydroepiandrosterone induces apoptosis of thymocyte through Fas/Fas-L pathway. Int Immunopharmacol 2004; 4: 1467-75. 18. Ardehali S, Moattari A, Hatam GR, Hosseini SMH, Sharidi I. Characterization of Leishmania isolated in Iran: Serotyping with species specific monoclonal antibodies. Acta Tropica 2000; 75: 301-7. 19. Mosmann T. Rapid colometric assay for cellular growth and survival: application to proliferation cytotoxicity assay. J Immunol Methods 1983; 65: 55-63. 20. Stafford JL, Neumann NF, Belosevic M. Macrophagemediated innate host defense against protozoan parasites. Critic Rev Microbiol 2002; 28: 187-248. 21. Mac Micking J, Xie QW, Nathan C. Nitric oxide and macrophage function. Annu Rev Immunol 1993; 15: 323-50. 22. Yang CH, Chen KJ, Wang CK, Wang CK. Communityacquired Acinetobacter pneumonia: a case report. J Infect 1997; 353: 316-18. 23. Abu-Osba YK, Mallouh AA, Hann RW. Incidence and causes of sepsis in glucose-6-phosphate dehydrogenas deficiency in newborn infants. J Pediatr 1989; 114: 748-52. 24. Siddiqui T, Khan AH. Hepatitis A and cytomegalovirus infection precipitating acute hemolysis in glucose-6- phosphate dehydrogenase deficiency. Mil Med 1998; 163: 434-35. 25. Thakur A, Verma IC. Interaction of malarial infection and glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. Trop Geogr Med 1992; 44: 201-5. 26. Heltzer ML, Sullivan KE. Unusual infections in a mother and son with G6PD and a defective oxidative burst. J Allergy Clin Immunol 2000; 115: 85-91. 27. Clark M, Root RK. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency and indection: a study of hospitalized patients in Iran. Yale J Biol Med 1979; 52: 169-79. 28. Vives Corrons JL, Felio E, Pujades MA, Cardellach F, Rozman C, Carreras A, et al. Severe glucose-6- phosphate dehydrogenase deficiency associated with chronic hemolytic anemia, granulocyte dysfunction and increased susceptibility to infections: description of a new molecular variant (G6PD Barcelona). Blood 1982; 59: 428-34. 29. Assreuy J, Cunha FQ, Epperlein M, Noronha-Dutra A, Odonnell CA, Liew FY, et al. production of nitric oxide and superoxide by activated macrophages and killing of Leishmania major. Eur J Immunol 1994; 24: 627-76.
Tehran University Medical Journal; Vol. 64, No. 9, Dec 2006:10-18 18 The role of 6-Aminonicotinamide in the resistance of peritoneal macrophages against Leishmania major infection in BALB/c mouse Sh. Zamani T.R. 1 A. Zavaran Hosseini 1 * S.A. Mesbah Namin 2 1- Department of Immunology. 2- Department of Biochemistry. Tarbiat Modares University Abstract Background: The objective of this study was to investigate the relationship between glucose-6-phosphate dehydrogenase inhibition in macrophages treated with 6-Aminonicotinamide, the amount of nitric oxide (NO) production and the resistance of infected macrophages against Leishmania major infection. Methods: Peritoneal macrophages of BALB/c mice were isolated and treated with different concentrations (1.25, 2.5, 5, 10 mm) of 6-aminonicotinamide. After 24 hours, the viability of treated macrophages was measured by MTT assay at 540 nm. G6PD activity was measured in the cell extracts 24 hours later. Macrophages were then infected with leishmanial amastigotes and after 18 hours NO production was determined using Griess-reagent. In order to study the inhibition of macrophage activity, 5 mm concentration of 6-AN was used and number of leishmanial amastigotes was recorded in these cells from day 1 to7. Results: Different concentrations of 6-AN were shown to cause a significant increase in cell death and decrease in G6PD activity and NO production in macrophages. Also, the number of amastigotes in macrophages was increased significantly (p < 0.05). Conclusion: The concentration of 6-aminonicotinamide and G6PD activity affect the viability of BALB/c mice peritoneal macrophages through production of NO. Inhibition of G6PD activity leads to decreased leishmanicidal activity of mouse peritoneal macrophages. Keywords: Leishmania major, G6PD, nitric oxide, MTT assay, 6-Aminonicotinamide * Department. of immunology Tarbiat Modares University Tehran, Iran. Tel: +98-21-88011001 Email: zavarana@modares.ac.ir